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理想的三聚氰胺检测方法

理想的三聚氰胺检测方法 2011年12月12日 来源： 常用于工业的三聚氰胺经常与甲醛混合制成一种因阻燃性能而广为人知的塑料——三聚氰胺－甲醛树脂。除了用于制造工作台面、写字板、层压板、粘胶剂、黏合剂、纸张以及织物以外，近来在一些食品中也发现了三聚氰胺的踪迹。调查发现，一些原材料供应商非法地将这种富含氮元素的化学物质添加至食品源中，制造蛋白质含量增加的假象。 一些奶农将牛奶稀释以增加利润，尤其是在技术发展缓慢、牛奶生产的利润率并未随效率的提高而增加的地方。这种稀释行为使得牛奶质量下降，蛋白质、脂肪以及糖的浓度显著降低。一些奶农稀释牛奶的程度高达30%，随后使用三聚氰胺掩饰这种欺诈行为。质量控制设备检测的是正常水平的氮元素（蛋白质含有的），三聚氰胺中高含量的氮能够在检测中蒙混过关，让造假的牛奶作为优质产品通过检测，从而显著地增加利润。 三聚氰胺与三聚氰酸结合后（通常见于三聚氰胺废渣中的一种杂质）在体内聚集，形成不溶晶体，产生严重的毒性。氰尿酸三聚氰胺吸收进入血液，在肾脏微管的尿液中聚集并发生作用。随后结晶，形成大量球形黄色晶体，堵塞并损伤微管中的肾脏细胞，导致严重的肾功能障碍。接触时间延长则会导致其他健康问题，例如生殖损伤、膀胱或肾结石、以及癌症。食品中蛋白质含量的标准检测方法是凯氏定氮法以及杜马斯燃烧法，两种方法测定的都是氮的含量。这些方法不能将三聚氰胺的氮与氨基酸中天然存在的氮元素区分开来。已经有高灵敏度的方法用于检测三聚氰胺，而不是测定氮元素。液相色谱（LC）可以单独使用，或是与串联质谱结合使用（LC/MS/MS），还可以将气相色谱与串联质谱结合使用（GC/MS/MS）。 这些色谱方法非常精确，但对于设备和操作而言，准备及运行的成本都非常高。因此迫切需要一个简单的高通量筛选方法，以合理的成本精确检测牛奶中三聚氰胺的残留量。 经典的ELISA（酶联免疫吸附测定）测量可以作为一个理想的解决方案。这种方法可以在微孔板中进行，因此样品数量较多时可以同时进行，仪器成本也不高。已经开发了免疫测定试剂盒，可以高效、简便、灵敏地检测乳制品、动物饲料以及宠物食品的原料中的三聚氰胺污染物。 本文是关于如何使用简便的ELISAs ，高灵敏地筛选牛奶样品中的三聚氰胺。这些检测需要具备足够的灵敏度，检出10礸以下的三聚氰胺，这是全世界的监管机构对非婴儿类食品设定的界限。

经典的ELISA（酶联免疫吸附测定）测量可以作为一个理想的解决方案来测定三聚氰胺含量。

检测原理 本研究中，使用了两种来自不同生产商、但是基本原理相同的三聚氰胺ELISA商品试剂盒。未知样品以及辣根过氧化物酶（HRP）标记的三聚氰胺均置于三聚氰胺抗体包被的微孔板孔中。HRP标记的三聚氰胺与未知样品中的三聚氰胺竞争结合抗体。结合率相当于HRP标记物与游离三聚氰胺的浓度比。因此，与抗体结合的HRP标记物的量与样品中游离三聚氰胺的数量反向相关。 结合阶段之后，使用微孔板清洗机去除未结合的物质，加入HRP显色底物。测定的HRP酶活与HRP标记的三聚氰胺的数量成正比，并且与未知样品中三聚氰胺的浓度有关。规定的孵育时间之后中止反应，测定形成的有色染料的量。如果样品中不存在三聚氰胺，通过形成的有色染料的数量及较高吸收值可以得知酶活水平较高。未标记的游离三聚氰胺的量增加，则活力水平和吸收值降低。因此根据校准曲线（随后讨论）就可以直接测定三聚氰胺的浓度。 样品制备 三个不同的牛奶样品——天然的全脂牛奶、脱脂牛奶以及天然奶粉制成的人造奶——加入纯的三聚氰胺。这三种不同的乳制品与三聚氰胺储备液（浓度为2mg/mL的蒸馏水溶液）混合制成加标样品。三种牛奶均加入20及100礸/L的三聚氰胺，全脂和脱脂牛奶样品另外再加入浓度为550及1,000礸/L的三聚氰胺。 对于第一种检测试剂盒，加标牛奶样品按试剂盒操作方法进行制备： ◆在洁净试管中加入大约1mL加标牛奶样品； ◆样品在1,500 g、10 ℃下离心10分钟； ◆取脂肪层下部分200礚转入洁净试管中；并且牛奶乳清中加入800礚检测稀释液，仔细混合稀释样品。 对于第二种试剂盒，根据生产商直接提供的信息，对样品的制备方法稍加调整，以提高检测灵敏度。如果根据原有的说明制备牛奶样品，会发现三聚氰胺检测灵敏度低于第一种方法，因为根据原有的说明检测样品被稀释过量： ◆洁净试管中加入大约1mL加标牛奶； ◆样品在1,500g、10 ℃下离心10分钟，分成3层； ◆取中层250礚，转入洁净试管中；并且 ◆取出液体以1:3的比例加入10%的甲醇/PBS溶液（20mM）。 “经典的ELISA（酶联免疫吸附测定）测量可以作为一个理想的解决方案。这种方法可以在微孔板中进行，因此样品数量较多时可以同时进行，仪器成本也不高。” 两种ELISA试剂盒的使用都参照生产商的说明。抗体包被的微孔中加入三聚氰胺标准品或加标样的加入量为100或150礚（取决于试剂盒）。随后每一个微孔中加入50礚 HRP——三聚氰胺标记物，混匀微孔板并在室温孵育30分钟。蒸馏水冲洗去除未结合的样品。300 礚蒸馏水重复冲洗4次。100礚 HRP——底物分装入每一个微孔中，微孔板在室温下再次孵育20或30分钟（取决于试剂盒）。加入100礚终止液终止反应，使用六种不同的酶标仪在450nm测定吸收值。制作校准曲线，用于确定未知浓度。（该曲线可以根据吸收值或是准确值进行计算，空白对照的吸收值被设定为100%。） 校准曲线及检验灵敏度 利用第一种试剂盒制作的三聚氰胺校准曲线，使用了六种不同型号的酶标仪进行测定。计算第二种试剂盒的校准曲线时，只使用了两种酶标仪。以前的数据显示检测仪对结果没有影响。该方法的检测限（LOD），是使用标准IUPAC 3*SD方法，根据校准数据以及空白对照样品的数据进行计算。 这些方法所需的测量范围，与所有酶标仪具有良好准确度的波长范围一致。这些方法的检测限在很大程度上取决于测光读数仪的准确度和精确度。因此，LOD值之间仅存在极小的不具备显著性的差异。对于两种试剂盒，低于10 礸/L的三聚氰胺浓度能够轻易检出。因此，ELISA方法检测三聚氰胺的准确度与LC/MS/MS相当。 三聚氰胺的测定 三种不同的牛奶加入纯的三聚氰胺，用两种试剂盒进行分析。采用一系列不同的光度计进行测量。 数据表明，两种试剂盒测定的酶活非常接近，回收率差异小于10%。此外，两种试剂盒都存在一个相同的趋势，即三聚氰胺高浓度样品的浓度测量值稍偏低；不过，这对这些方法的使用不会产生影响，因为所有样品还会作为筛选检测的高浓度阳性样品进行测定。因此，结果明确表明，ELISA检测适合用于筛选，包括未知牛奶样品中三聚氰胺的检测。 根据前述结果，两种测试都能用于准确测定乳制品中三聚氰胺的残留量。测试的灵敏度与质谱分析的灵敏度相当。不过，与色谱方法相比，ELISAs具有成本方面的优势。这种简便、高通量的筛选方法能够以较低的仪器成本、适中的运行价格，对上千个样品进行大规模的筛选。 虽然这些方法对牛奶样品中高浓度三聚氰胺的测定值稍低，但是其灵敏度达到的水平依然适合对三聚氰胺进行筛选，作出有/无的判断。当这些方法用于筛选时，阳性样品随后仍然需要使用LC/MS/MS 或 GC/MS/MS方法确定三聚氰胺的确切含量。 这种快速（总的检测时间：大约1小时）并且具备成本效益的方法可以检测牛奶中三聚氰胺的残留量，从而对乳制品进行高效的筛选，这确保了任何污染物都能被快速、简便地发现。(end)

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